毛细管电泳技术——助力糖组学应用领域研究及发展

目前，毛细管电泳技术正作为糖链分析常用的一种技术手段，具备灵敏度高、快速、高通量、分离效率高、样品消耗少以及适用性广等特点，可为科研人员提供更加全面、准确、高效的糖组学研究工具，进一步推动糖组学领域的发展。

其中，2024年6月，Gordan Lauc教授和王嵬教授作为共同通讯作者在国际期刊《GeroScience》发表了题为《Glycan clock of ageing—analytical precision and time‑dependent inter‑ and i‑individual variability》的论文。该研究采用毛细管电泳法分别观察了聚糖在个体间和个体内的短期和长期变异性，并强调了聚糖作为跟踪年龄相关变化和个体健康生物标志物的可靠性。

衰老是一个复杂的生物过程，个体之间存在差异，因此人们开发了衰老时钟来估计生物学年龄。聚糖，尤其是免疫球蛋白 G（IgG）中的聚糖，已成为衰老的潜在生物标志物，糖基化模式的变化与实际年龄相关。

为了进行精密度分析，在26天内对三个不同的血浆池进行了四次分析，总共312个样本。在短期变异性分析中，分析了两个队列：阿斯利康MFO队列由26名健康个体（中位年龄20岁）组成，以及一个由70名绝经前中国女性（中位年龄22.5岁）组成的队列，监测时间超过3个月。长期变异性分析涉及两名分别为47岁和57岁的成年男性，监测时间分别长达5年和10年并分别每3个月、每3周采集一次样本。IgG N-聚糖分析遵循标准化方法，即分离IgG，随后进行变性和去糖基化，然后进行聚糖纯化和标记。采用激光诱导荧光毛细管凝胶电泳 (CGE-LIF) 和超高效液相色谱分析进行聚糖分析。数据分析涉及标准化、批次校正和线性混合模型，以评估时间对衍生聚糖特征的影响。

在所有三个测试样品中，中间精度结果始终表现出非常低的变异系数值。这种一致的模式强调了CGE方法在分析聚糖衰老时钟方面固有的高精确度。阿斯利康MFO队列未显示任何统计学上显著的趋势，而月经周期队列在双半乳糖基化 (G2)、无半乳糖基化 (G0) 和岩藻糖基化 (F) 方面表现出统计学上显著的趋势，这些趋势归因于月经周期的影响。长期稳定性分析确定了两个受试者的持久年龄相关趋势，显示G0和二分N-乙酰葡萄糖胺具有正时间效应，以及G2和唾液酸化具有负时间效应，这与早期发现一致。单半乳糖基化和F的测量时间效应显著低于其他性状的观测值。

研究发现，使用CGE-LIF的IgG N-聚糖分析表现出非常高的中间精度。此外，该研究还强调了IgG聚糖组成的短期和长期稳定性，并具有显著适应和响应生理变化和环境影响（如激素变化、疾病和干预措施）的能力。这项研究发现通过加深我们对IgG糖组与年龄相关健康问题关系的理解，推动了个性化医疗的发展。这项研究还强调了聚糖作为跟踪衰老变化和个人健康的生物标志物的可靠性。

衰老是一种多方面的生物学现象，其特征包括复杂的分子、细胞和生物体转化。这些变化在不同个体中表现出不同的时间依赖性。值得注意的是，一些个体在高龄时仍保持强健的健康状况，衰老速度非常缓慢。相反，其他人则加速衰老，导致预期寿命缩短，更容易患上与年龄有关的疾病。因此，近年来开发了几种衰老时钟，主要目的是估计生物学年龄。早在1988年，就有报道称聚糖是一种与衰老相关的生物分子，研究已经将聚糖作为衰老的潜在生物标志物进行研究，包括血清N-聚糖谱和免疫球蛋白G（IgG）的N-聚糖谱。

糖蛋白的活性和功能，包括体液免疫的主要分子IgG都受到N-糖基化的显著影响。人类IgG糖基化模式的变化被发现与许多生理、病理状态和过程有关。IgG糖基化在某些生理状态下具有高度可重复性。尽管如此，糖基化模式的变化已被反复报道为生物衰老的有力和可靠的标志。N-糖基化模式会随着年龄的增长而改变。大多数研究衰老过程中IgG糖基化变化的研究一致报告称，IgG糖基化模式在成年早期表现出不同的特征，双半乳糖基化 (G2) 结构丰度最高，无半乳糖基化 (G0) 结构丰度最低。然而，随着个体年龄的增长，半乳糖基化水平明显下降，同时G0、N-乙酰葡萄糖胺 (B) 含量增加。单半乳糖基化（G1）在衰老过程中表现出稳定。在衰老过程中，核心岩藻糖基化 (F) 和唾液酸化 (S) 也发生了变化。然而，关于这些变化的方向仍未达成共识，尽管在衰老过程中，更普遍的观察结果是唾液酸化(S) IgG结构的丰度下降。IgG聚糖作为衰老生物标志物的可靠性已得到证实，它解释了相当一部分（高达64%）的年龄变化。

有关聚糖衰老时钟的短期和长期稳定性的数据对于将其用作测量生物学年龄的生物标志物非常重要。鉴于IgG N-糖基化在健康和疾病中的关键作用，本研究旨在通过评估Genos-GlycanAge IgG糖组分析测试的分析精度，并研究个体IgG N-糖组的短期和长期稳定性来解决现有的研究空白。为了解决这一空白，本研究有三个目标：第一，评估测试的中间精度；第二，评估短期个体间变异性；第三，探索长期个体内变异性。通过在26天内对三个不同的血浆池进行四次分析来探索分析方法的中间精度。此外，该研究连续观察了一组年轻健康个体3个月，并对另一组绝经前女性进行了为期12周的监测，以确定IgG N-糖组的短期稳定性。最后，该研究纵向跟踪了两个受试者：一个受试者持续跟踪5年，另一个受试者持续跟踪10年。这些不同的观察期使我们能够评估个体IgG N-糖组谱的短期和长期稳定性。这项研究的结果可以增强我们对聚糖动力学的理解及其作为衰老过程可靠指标的潜在效用，填补与年龄相关的研究领域的关键知识空白。

中间精密度用于评估多次运行结果的可重复性，使用CGE-LIF方法对26个样品板上的三个不同血浆池样品进行四次分析。表1、2和3包含为每个聚糖峰（1至27）和衍生聚糖特征G0、G1、G2、S、B和F计算的CVs（变异系数）。值得注意的是，聚糖峰的CVs通常在10%以下。GP20在所有聚糖峰中表现出最大的变异，而GP14和GP1显著不同，它们的CVs始终超过10%。在研究衍生聚糖性状变异时，所有性状的CVs均低于3%，其中S性状始终表现出最高的变异性（2.24–2.75%），而 F性状表现出最低的变异性，CVs范围为0.21至0.28%（表1、2和3）。

表1、2、3 显示了标准品4/5/6的运行间精度分析结果，包括各种电泳图峰（即直接测量的聚糖特征）

注：第一列标明了每个聚糖峰 (GP) 或衍生的聚糖特性（即糖基化特性），其后为总均值(x̄̄)，表示所有运行的平均测量值；组间标准差(Sb)，表示不同实验运行或批次之间的变异性；变异系数 (CV)，以百分比表示运行间精度。相应的字母 (G0、G1、G2、S、B、F) 代表不同的糖基化特性：G0代表无乳糖基化，G1代表单半乳糖基化，G2代表双半乳糖基化，S代表唾液酸化，B代表二分N-乙酰葡萄糖胺，F代表蛋白质结构中的核心岩藻糖基化。

评估短期稳定性

AMC（阿斯利康MFO队列）

鉴于月经周期对IgG糖基化的已知影响，我们对男性和女性参与者进行了单独的统计分析。对于10名男性年轻个体，在整个队列中，所有聚糖特征都表现出显著的稳定性，群体间差异最小（图1）。相比之下，28名女性参与者的队列表现出更明显的IgG糖基化波动（图2）。

图1 显示了10名男性在90天内每种衍生聚糖特征（G0、G1、G2、S、B、F）随时间变化的趋势。x轴表示以天为单位的时间，而y轴则显示每种聚糖特征相对丰度的标准化值。数据标准化是通过将每个数据点值除以其在初始点的对应值进行的。

CPWC（绝经前中国女性队列）

为了进一步研究短期个体间聚糖变异的影响，我们又招募了另一组经历月经周期的女性参与者，其中70人接受了为期12周的观察。我们观察到了与 AMC中观察到的类似的动态（图 3）。

在分析G1、B和S的衍生聚糖特性时，研究发现它们在整个研究期间保持稳定，没有观察到统计学意义上显著的趋势（附表S4和图3）。另一方面，G0、G2和 F显示出统计学上显著的趋势。G2和 F显示出正时间效应，而G0表现出负时间效应。值得注意的是，即使在应用多次检验校正后，F和G2的时间效应仍然具有统计学意义（附表S4 和图3）。

图3 显示了70名女性在12周期间每种衍生聚糖特征（G0、G1、G2、S、B、F）随时间变化的趋势。x轴表示以周为单位的时间，而y轴显示每种聚糖特征相对丰度的标准化值。数据标准化是通过将每个数据点值除以其在初始点的对应值进行的。绿色标题显示聚糖特征统计学上显著增加，而红色标题显示聚糖特征统计学上显著减少。

评估长期稳定性

五年的长期稳定性

为了检验长期稳定性，我们招募了一名参与者，在5年的时间内每3个月采集一次样本。G0的相对丰度在5年期间增加了约 15%，时间效应为 0.000051。相反，S性状在整个期间内减少了约10.5%，时间效应为-0.000073。G2显示出与衍生性状S相同的模式，时间效应为-0.000051。相比之下，性状G1和F在整个观察期内保持相对稳定，时间效应为 0.000007，与其他性状相比变化最小（图4）。此外，B显示的时间效应较小，为 0.000009（附表S5）。

图5 在10年期间观察到的男性中每种衍生聚糖特征（G0、G1、G2、S、B、F）随时间变化的趋势。x轴表示特定日期随时间的变化，而y轴显示每种聚糖特征相对丰度的标准化值。数据标准化是通过将每个数据点值除以其在初始点的对应值进行的。

在本文中，我们对CGE-LIF方法的中间精度进行了两个不同的队列分析，评估了短期个体间变异，并分析了两个不同的个体来评估长期个体内变异。

“聚糖衰老时钟”概念的提出为我们深入了解与年龄相关的研究提供了一个全新的视角。值得注意的是，IgG N-聚糖已显示出可靠地量化衰老过程中分子变化的潜力。这项研究强调了IgG N-聚糖组成的卓越精度和短期稳定性，以及显著的适应和应对生理变化和环境影响的能力，尤其是在10年的随访中。总之，我们的研究阐明了聚糖衰老时钟的时间依赖性动力学和分析精度，突出了其作为监测个人健康轨迹的生物标志物的潜力。通过揭示生理过程、环境因素和聚糖组成之间复杂的相互作用，我们的研究结果强调了糖组学研究在推进个性化医疗和理解衰老复杂性方面所发挥的良好作用。

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