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Sanger DNA测序

  Sep 06       256        互联网

Sanger DNA测序

       原理:采用核苷酸链终止剂-双脱氧核苷酸 ddNTP终止DNA链的延长。根据这一方法,利用DNA聚合酶1的聚合反应,在反应混合物中加入模板、放射性标记的引物,DNA聚合酶1和四种dNTP,另外加入一定比例的2’, 3’-ddATP, 当合成时ddATP参与后,链将不能再延伸而停止,这样就可得到一组以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段。



       DNA聚合酶(DNA Polymeras,EC编号2.7.7.7)是一种参与DNA复制的酶。它主要是以模板的形式,催化脱氧核糖核苷酸的聚合。聚合后的分子将会组成模板链并再进一步参与配对。DNA聚合酶以脱氧核苷酸三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、或dTTP,四者统称dNTPs)为底物,沿模板的3‘→5’方向,将对应的脱氧核苷酸连接到新生DNA链的3'端,使新生链沿5'→3'方向延长。新链与原有的模板链序列互补,亦与模板链的原配对链序列一致。

DNA体外扩增

       聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是除了基因克隆和基因文库以外,获取大量特定DNA片段的一种方法。在PCR反应中,使用Taq酶或者其他热稳定的DNA聚合酶对长链的DNA模板、甚至是一条染色体上特定的DNA序列片段进行指数式的扩增。扩增片段的大小由一对分别与双链DNA模板中的一条互补的短链寡核苷酸引物所决定。这使得在对DNA序列片段进行PCR扩增时,必须预先知道待扩增片段的部分侧翼序列。

       1993年,Mullis由于发明PCR技术而获得诺贝尔化学奖。

Sanger DNA测序反应

       分成4组,每一组反应体系中加入相应的4种dNTP和一种 ddNTP,反应后可得到不同长度的以双脱氧核酸结尾的 DNA片段,各DNA片段均只相差一个核苷酸长度。各组的片段经凝胶电泳分离后,每一片段 的电泳位置不同,从下而上可直接读出DNA序列。